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SDS-PAGE測定蛋白質分子量及純度
釋出時間╃·:2016-12-07   點選次數╃·:3955次

一₪•↟₪、實驗目的與原理

蛋白質在聚丙烯醯胺凝膠中電泳時₪☁↟₪·,它的遷移取決於它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素│☁。1967年Shapiro等人發現₪☁↟₪·,如果在聚丙烯醯胺系統中加入陰離子去汙劑十二烷基磺酸鈉(SDS)₪☁↟₪·,大多數蛋白質能與SDS按一定比例結合₪☁↟₪·,即每克蛋白質結合1.4g的SDS-複合物都帶上相同密度的負電荷₪☁↟₪·,它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量₪☁↟₪·,因而消除了蛋白質原有的電荷差別₪☁↟₪·,使蛋白質分子電泳的遷移率主要取決於本身的分子量₪☁↟₪·,而與蛋白質所帶的電荷無關₪☁↟₪·,在一定條件下₪☁↟₪·,蛋白質的分子量的對數與電泳遷移率間呈負相關│☁。

本實驗的目的是對多酚氧化酶的純化度鑑定及分子量的測定₪☁↟₪·,透過實驗₪☁↟₪·,學習和掌握SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法蛋白質純度和分子量的鑑定│☁。

二₪•↟₪、儀器與試劑

1₪•↟₪、材料╃·:

硫酸銨鹽析沉澱的多酚氧化酶粗酶樣品₪•↟₪、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品₪☁↟₪·,Sephadex G-100柱層析的樣品│☁。

2₪•↟₪、試劑╃·:

(1)丙稀醯胺(Acr母液)╃·:30%Acr (Acr/Bis)

(2)10%的SDS溶液

(3)10%的過硫酸銨溶液

(4)四甲基乙二胺(TEMED)

(5)分離膠緩衝液╃·:1.5M Tris₪☁↟₪·,PH8.8

(6)濃縮膠緩衝液╃·:1.0M Tris₪☁↟₪·,PH6.8

(7)電極緩衝液╃·:10×30g Tris₪☁↟₪·,125g 甘氨酸和5g SDS₪☁↟₪·,加水溶解定容至1000ml₪☁↟₪·,pH8.3

(8)樣品緩衝液╃·:0.2M Tris₪☁↟₪·,PH6.8₪☁↟₪·,1%SDS₪☁↟₪·,30%甘油₪☁↟₪·,巰基乙醇及溴酚蘭

(9)染色液╃·:0.15%考馬斯亮藍R250₪☁↟₪·,溶於脫色液

(10)脫色液╃·:50%的甲醇₪☁↟₪·,7%的冰醋酸的水溶液

(11)標準分子量蛋白│☁。

3₪•↟₪、儀器裝置╃·:

電泳儀₪•↟₪、垂直電泳槽等│☁。

三₪•↟₪、操作步驟

1₪•↟₪、凝膠製備╃·:

用兩塊電泳玻璃板製成垂直板槽(不能漏膠)₪☁↟₪·,垂直放置│☁。將配製好的分離膠溶液倒入₪☁↟₪·,滴加入無離子水₪☁↟₪·,待凝膠聚集後₪☁↟₪·,倒出無離子水₪☁↟₪·,用吸水紙吸乾₪☁↟₪·,倒入濃縮膠₪☁↟₪·,再插入梳子│☁。

2₪•↟₪、上樣╃·:

分別取樣品若干ml於離心管中₪☁↟₪·,按1/1~1/5比例加入5×樣品緩衝液₪☁↟₪·,再沸水浴中加熱3~5min₪☁↟₪·,取出待用│☁。用微量注射器分別吸取不超過 30μl不同濃度的標準蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽│☁。點樣結束後₪☁↟₪·,調節電泳儀電流到10mA(2~3mA/em)₪☁↟₪·,保持電流穩定不變₪☁↟₪·,當溴酚藍遷移到離分離膠底1~2cm時₪☁↟₪·,即可停止電泳│☁。

3₪•↟₪、染色╃·:

電泳完畢後₪☁↟₪·,取出凝膠板₪☁↟₪·,浸入染色液中₪☁↟₪·,在37℃溫箱中保溫過夜│☁。倒掉染色液₪☁↟₪·,24h後₪☁↟₪·,即可看到清晰的蛋白質條帶│☁。

四₪•↟₪、結果 (略)

五₪•↟₪、注意事項

1₪•↟₪、SDS與蛋白質的結合按質量成比例(即╃·:1.4gSDS/g蛋白質)₪☁↟₪·,如果比例不當₪☁↟₪·,就不能得到準確的資料│☁。

2₪•↟₪、用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質相對分子量時₪☁↟₪·,必須同時作標準曲線│☁。不能利用這次的標準曲線作為下次用│☁。

3₪•↟₪、有些蛋白質由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上肽鏈(α-胰凝乳蛋白酶)組成的₪☁↟₪·,它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈│☁。因此₪☁↟₪·,對於這一類蛋白質₪☁↟₪·,SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量│☁。

4₪•↟₪、有的蛋白質(如╃·:電荷異常或結構異常的蛋白質;帶有較大輔基的蛋白質)不能採用該法測相對分子量│☁。

5₪•↟₪、如果該電泳中出現拖尾₪•↟₪、染色帶的背景不清晰等現象₪☁↟₪·,可能是SDS不純引起│☁。

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